Джузеппе ди Стефано родился в деревне Мотта Сант'Анастазия, близ Катании в Сицилии в семье сапожника и его жены портнихи. Своё образование он получил в иезуитской семинарии и в юности даже собирался стать священником.

После прохождения службы в итальянской армии состоялся его дебют в опере Жюля Массне «Манон», а спустя год он дебютировал с этой же оперой в театре Ла Скала. Лирический тенор ди Стефано был быстро оценён мировой публикой и в дальнейшем он добился наивысшего успеха и признания в Метрополитен Опера в Нью-Йорке. Его американский дебют состоялся в 1948 году в опере Джузеппе Верди «Риголетто». В Великобритании он дебютировал в 1957 году на Эдинбургском фестивале в качестве Неморино в опере «Любовный напиток», а в 1961 году он впервые выступил в Королевском театре Ковент-Гарден в роли Марио Каварадосси в опере «Тоска».

На протяжении всей карьеры зрители восхищались его прекрасной дикцией, уникальным тембром и бархатным мягким пением. Из-за более тяжёлых ролей, не подходивших для его лирического тенора, которые Джузеппе ди Стефано стал брать в 1950-х годах, его голос стал ухудшаться, из-за чего в 1960-х чуть не завершилась его карьера.

Его сотрудничество с Марией Каллас началось в 1953 году с записи совместного альбома популярных итальянских опер. В последующие годы они часто выступали вместе, а также приняли участие в записях опер «Лючия ди Ламмермур», «Пуритане», «Тоска», «Паяцы», «Риголетто», «Травиата», «Трубадур», «Богема», «Бал-маскарад» и «Манон Леско». В 1973 году ди Стефано сопровождал Каллас во время её прощального турне, которое неожиданно прервалось спустя год из-за проблем с голосом у обоих исполнителей.

За годы своей карьера ди Стефано был удостоен премии «Золотой Орфей», престижной итальянской музыкальной премии. Последний раз в качестве оперного певца он выступил в 1992 году в опере Джакомо Пуччини «Турандот», где пел в роли старого императора.

В ноябре 2004 года ди Стефано с женой собирались покинуть свою виллу на курорте Диане Бич, недалеко от Момбасы в Кении, когда на них напали неизвестные и жестоко избили певца. Ди Стефано в течение нескольких недель не приходил в себя, и перенёс при этом две операции. В декабре 2007 года его доставили в одну из клиник Милана, где он впал в кому, из которой так и не вышел. Он был перевезён в свой дом в городок Санта-Мария-Ое, близ Милана, где 3 марта 2008 года скончался в возрасте 86 лет.

Ди Стефано в роли Радамеса в «Аиде».